2. ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (ДНК)

Както вече описахме в предходните раздели при прокариотите наследствената информация на клетката е разположена в гигантска кръгова молекула ДНК, носеща името нуклеоид. При еукариотните организми наследствената програма е многократно по-голяма, поради което дължината на полинуклеотидните вериги и в частност тази на ДНК е значително увеличена. С постоянното усложняване на организмовите функции дължината на ДНК молекулите постоянно се увеличавала, което наложило оформянето на специализиран органел, в който да се съхранява наследствената информация и така се оформило клетъчното ядро при еукариотните организми. За да се поберат дългите молекули на ДНК в ядрото на клетката те трябва да претърпят промени, които да ги компактизират – свързване с хистонови и нехистонови кисели белтъчини, т.е. създава се хроматин. Освен в клетъчното ядро ДНК молекули се съдържат и в митохондриите и пластидите, за които се предполага, че са древни форми на живота, с които съвремените организми са в симбиоза.

Използвайки информацията получена от рентгенолозите Розалинд Франклин и Морис Уилкинс през пролетта на 1953 година Джеймс Уотсън и Франсис Крик построяват модел на пространствената структура на молекулата на ДНК. Розалинд Франклин и Морис Уилкинс през 1952 г. установяват, че ДНК  има формата на спирала с диаметър 2 nm. Разстоянието между два съседни оборота е 3.4 nm, а между две съседни нуклеотидни бази – 0.34 nm. В един оборот на спиралата се съдържат 10 бази. Плътността на ДНК показва, че спиралата съдържа две полинуклеотидни вериги. Диаметърът е постоянен по цялата дължина на молекулата, което може да се обясни с разположението на базите вътре в спиралата насочени една срещу друга. За жалост Розалин Франклин се разболява и умира от рак поради което Нобеловата награда за откритието била присъдена само на двамата изследователи от университета Кеймбридж – Великобритания. Представеният модел на показва, че наследствената информация е закодирана в последователното подреждане на нуклеутидите в двойноверижна структура. Установено било, че ДНК е двойноверижна спирална молекула, чиито полинуклеотидни вериги са комплементарни и успоредни една на друга. Първичната структура се определя от броя, вида и последователността на отделните нуклотиди в молекулата на ДНК, а вторичната се определя от специфичната пространствена конформация, която молекулата заема.

Базите на срещуположните вериги са свързани по между си посредством водородни връзки и така те застават в една плоскост, при което по между им възникват и вертикални взаимодействия познати като стекинг взаимодействия. Всяка база е свързана с две или три водородни връзки към базата от отсрещната верига. Когато са в молекулата на ДНК водородните атоми са относително стабилни и образуват амино (-NH2) и кето (-CO) групи. Водородната връзка се образува между NH₂ и CO-групите на двете бази. Имайки предвид структурата и размера на базите това условие изисква А от едната верига да свърже с Т от другата верига, а Г да се свърже с Ц. При А-Т двойката съществуват две водородни връзки, а при Г-Ц двойката три. Тези двойки са известни като Крик-Уотсънови двойки. При разрушаване на двойната спирала могат да се образуват алтернативни тавтомерни форми – имино (-NH) и енолни (-COH) групи. От химична гледна точка водородните връзки са сравнително слаби, но огромният им брой в молекулата на ДНК придава изключителна стабилност на спиралата. Наличието в дезоксирибозата при 2’ въглеродния атом само на водород в сравнение с рибозата прави ДНК по-слабо реактивоспособна, но многократно по-стабилна в сравнение с РНК. Именно този феномен е наложил молекулата на ДНК като носител на наследствената информация, а РНК е само нейн преносител. Азотните бази на нуклеотидите са насочени към вътрешността на спиралата, като че ли са скрити в нея.

При създаването на пространственият модел Уотсън и Крик използвали и данните на един виден по онова време химик Ъруин Чаргаф. Той изследва чрез хартиена хроматография нуклеотидния състав на ДНК и установява, че количеството на адениновите остатъци е равно на количеството на тиминовите, а количеството на гуаниновите – на цитозиновите, т.е. съотношението между пуриновите и пиримидиновите бази е 1:1. Резултатите от тези анализи  са познати като правило на Чаргаф. Това е и основният отличителен белег на двойната спирала на ДНК при нейното изграждане винаги срещу пуринова база от едната верига се свързва пиримидинова от другата – срещу Аденин винаги се свързва Тимин, а срещу Гуанин винаги се свързва Цитозин. Това правило било наречено комплементарност, т.е. съответствие (допълване) между базите. Единствено по този начин може да се изгради спирала по дължината, на която разстоянието между двете вериги да бъде еднакво. Описаната комплементарност на между двете вериги предопределя и механизмът на синтез на нови копия от молекулата, на което ще се спрем по-подробно в разделът репликация.

В единият край на молекулата винаги има хидроксилен анион (3’), а в другият фосфатна група (5’), което позволява молекулата да бъде удължавана почти неограничено. В повечето случаи ДНК са прави, неразклонени и отворени вериги, но при някои прокариоти, митохондриите и пластидите, двата края – 3’ и 5’ се свързват и образуват пръстеновидна молекула ДНК.

Пръстеновидните молекули ДНК (при бактериите, пластидите, митохондриите) са важен етап от еволюцията на генома. С развитието на организмите молекулата на ДНК постепенно увеличава размерите си, докато в един момент пръстеновидната форма била заменена с линейна. Линейни са всички молекули на еукариотната хромозома, както и ДНК на много вируси и фаги. Линейните молекули съществуват по-скоро като големи примки като свободните краищата на всяка примка контактуват в основата по такъв начин, че тя става подобие на пръстен. При някои прокариоти линейните и пръстеновидните форми на ДНК не се различават много ясно. Така при изолирането на ДНК от някои фаги тя има линейна форма, а в клетката на гостоприемника се намира в пръстеновидна форма. Тези изследвания доказват, че ДНК може да променя формата си в зависимост от условията при които е поставена.

Описаният до момента строеж на молекулата на ДНК недвусмислено показва нейната изключителна стабилност, но тя притежва и способността да се променя. Под въздействието на различни фактори на външната среда е възможно един нуклеотид от веригата да бъде заменен с друг, което променя смисъла на генетичният код. Единствено комбинацията от стабилност и изменчивост може да осигури изпълнението на комплексните биологични функции на нуклеиновите киселини. ДНК съхранява цялата информация нужна за съществуването на клетката – нейните структурни и функционални особености.

Суперспирализация на пръстеновидни ДНК

Наличието на пръстеновидни молекули ДНК е предпоставка за промяна в конформацията на ДНК спиралата. Най-често се наблюдава усукване на двойната спирала около собствената и ос, което води до образуването на вторична спирала. Такава молекула се нарича суперспирализирана. Суперспирализацията се извършва единствено при затворени структури, защото линейните молекули ДНК биха могли лесно да се деспирализират чрез разсукване на срещуположният край. Молекулите при които не се наблюдава суперспирализация се обозначават като релаксирани.

Съществуват два типа суперспирализация – положителна и отрицателна. При отрицателната суперспирализация посоката на усукване е обратна на вътрешната посока на двойната спирала ДНК. При този тип спирализация ДНК веригата облекчава торзионното напрежение и разхлабва увиването между двете си вериги. Резултатът от негативната суперспирализация е намаляването на броя на нуклеотидите в един оборот на спиралата. Такава ДНК верига се обозначава като разсукана.

При положителната суперспирализация веригата на ДНК се увива в посока на вътрешната ос на спиралата. Тя засилва торзионните сили и повишава стегнатостта на веригата. Такава ДНК верига се означава като преосукана.

За провеждането на отрицателната спирализация са необходими два фактора – енергия и суперспирализирана молекула, поради което се смята че суперспирализираната молекула е енергийното хранилище на ниво ДНК. Суперспирализираната ДНК молекула може да претърпи различни условия на средата, при които релаксираната ДНК не би оцеляла. Пример можем да дадем с локалното раделяне на двете вериги при контакта на веригата с ензима ДНК полимераза при процеса на транскрипция.

Генетичен код

Функциите и структурата на всяка клетка се определят от специфичните за нея полипептиди – белтъци. ДНК веригите са изградени от четири нуклеотида подредени във всички възможни комбинации един след друг, докато аминокиселините изграждащи белтъците са общо 20 на брой. Установяването на връзка в последователността между нуклеотидите в ДНК и последователността на аминокиселините в полипептидите е едно от най-големите открития в биологията. Благодарение на опити проведени с фаг Т4 е установено, че мястото и видът на всяка аминокиселина в полипептидната верига се определя от последователното подреждане на три нуклеотида в молекулата на ДНК, които се обозначават като кодон или триплет. Възможните комбинации от тройки нуклеотиди (кодони) са 64 и далеч надвишават броят на възможните аминокиселини. Подредените в полинуклеотидната верига нуклеотиди образуват кодоните един след друг. Ако една полинуклеотидна верига е съставена от следната последователност: УУЦЦУЦАААГАУГГУААУ, то кодоните са: (УУЦ)(ЦУЦ)(ААА)(ГАУ)(ГГУ)(ААУ). При прочитането на веригата последователността на нуклеотидите кодира последователността на аминокиселините в белтъчната молекула. Важно условие е да се спазва посоката при четене на информацията в противен случай тя променя смисъла си и като следствие се синтезират „грешни” белтъци. Тъй като споменахме, че аминокиселините в полипептидните вериги са общо 20 на брой, а възможните нуклеотидни комбинации 64 трябва да отбележим, че едни аминокиселини се кодират само от един кодон (метионин), други се кодират от два или повече кодона (аргинин, серин, лизин и др.) като независимо кой от кодоните се открива във веригата винаги към полипептида се присъединява определената аминокиселина. Когато положението на дадена аминокиселина се кодира от няколко триплета генетичният код се бележи като изроден. Прави впечатление, че повечето от кодоните, които кодират една и съща аминокиселина се различават само по един нуклеотид. Кодоните отговорни за синтезата на ароматните аминокиселини (триптофан - УГГ, тирозин – УАУ и УАЦ, фенилаланин – УУУ и УУЦ) винаги започват с азотната база урацил. Ако вследствие на мутация даден нуклеотид бъде заменен с друг вероятността клетката да присъедини същата или една от другите две ароматни аминокиселини е доста голяма. Макар и включена погрешно в полипептидната верига тази аминокиселина няма да увреди сериозно функционалните особености на белтъчината. Съществуват три кодона които не кодират нито една аминокиселина – УАА, УАГ и УГА. Това са така наречените стоп кодони, които определят кога да настъпи терминацията на транслацията. Генетичният код е универсален за всички живи организми населяващи нашата планета. Ако пренесем иРНК от бозайник в клетки на бактерии в повечето случаи бактериите започват да синтезират специфичен за човека белтък. Балгодарение на този факт е възможно пренасянето на ген от човек в бактерии, които да служат като инкубатор за производство на специфичен за човека белтък. Именно чрез тези похвати на генното инженерство се произвежда ценният за диабетно болните хора хормон инсулин. Отклонение от описания генетичен код се наблюдава единствено при митохондриите. Предполага се, че митохондриите са наследници на древни микроорганизми, които са симбионти с еукариотните клетки. При тях безмисленият кодон УГА кодира аминокиселината триптофан, а кодиращият аминокиселината левцин кодон ЦУГ при митохондриите кодира аминокиселината треонин. Като изключим митохондриите трябва да отбележим универсалността на генетичният код сред огромното разнообразие от живи организми. Тази негова уникалност предполага, че той е възникнал на много ранен етап от еволюцията на организмите. Въпреки универсалността на генетичният код най-нови изследвания в молекулярната биология доказват „предпочитане“ на определени кодони при различните организми. Така аминокиселината Аргинин се кодира от шест кодона – ЦГУ, ЦГЦ, ЦГА, ЦГГ, АГА и АГГ. За транслирането на всеки един от тях са нужни шест транспортни РНК молекули, съдържащи съответните антикодони комплементарни на всеки един от посочените шест кодона в молекулата на иРНК. Доказа се, че макар посочените  шест кодона да кодират една и съща аминокиселина при различните организми клетките разполагат предимно с един или два вида тРНК комплементарни само на два от кодоните, а останалите се срещат много рядко. Това обяснява защо изокодоните се срещат с различна честота при различните видове. Този факт затруднява пренасянето на гени от един организмов вид на друг, защото реципиентната клетка разполага с твърде малко тРНК, които да пренасят съответните аминокиселини до рибозомите. В такива случаи транслацията протича много бавно или дори се преустановява. Тези открития поставят нова бариера пред трансгенозата и генното инженерство.

Таблица на кодоните и кодираните от тях аминокиселини.

Що е ген?

Участък от веригата на ДНК, който кодира информация за синтез на една полипептидна верига (белтък) се нарича ген. Генът е най-малката функционална единица за наследственост. Гените са функционално неделима част от генетичния материал - участък от молекулата на ДНК със специфичен набор нуклеотиди (от няколко до 15-1600), в чиято линейна последователност е закодирана генетичната информация. Като част от веригите на ДНК гените влизат в състава на хромозомите. Съвкупността от всички гени в организма съставя неговия генотип. Дискретните наследствени фактори са открити през 1865 г. от монахът Грегор Мендел, а през 1909 г. Вилхелм Йохансен ги нарича гени. Гените контролират всички биохимични реакции в организма и определят признаците му чрез специфичните за него белтъци. Генът определя изявата на даден белег и може да има различни алелни състояния (например ген за цвят, алели за жълт и за зелен цвят). Алелните състояния на всеки ген може да са повече от две, но във всеки конкретен индивид, поради диплоидността, присъстват само два алела на всеки ген като единият може да доминира над другия. За изясняването на локализацията и функционирането на наследствените фактори голяма заслуга има Т. Морган. Броят на гените е коренно различен при различните видове и класове организми като въпреки огромните услия, които се полагат точният брой гени и интимните механизми на тяхното функциониране при всеки вид все още не е изяснен. Трябва да отбележим, че част от генома на всеки индивид е строго специфична (единствено за него). Съвсем скоро се доказа, че дори еднояйчните близнаци притежават участъци от ДНК които се различават. Тези открития са в основата на съвременните ДНК анализи за доказване на бащинство в криминалистиката и за доказване на извършител на престъпление и др. Изучаването на пълния генен състав на човешката ДНК е един от най-амбициозните проекти на молекулярната генетика. Благодарение на проекта „Човешки геном“ се откриха много нови гени и техните функции в организма. Резултатите от него дават нови хоризонти пред превантивната медицина, фармакогенетиката и други ДНК базирани технологии.

 

СТРУКТУРА НА ДНК ПРИ ПРОКАРИОТИТЕ И ЕУКАРИОТИТЕ

В процеса на еволюцията структурата на ДНК молекулата при еукариотните организми е претърпяла развитие в резултат на което размерите и са се увеличили значително в сравнение с прокариотите. При прокариотните организми цялата наследствена информация е базирана в една двойноверижна кръгова молекула, докато при еукариотите генетичната програма е няколко степени по-голяма и е разположена в няколко линейни вериги ДНК, всяка от които е разположена в отделна хромозома.

Увеличаването на размерите на ДНК молекулата при еукариотите се дължи на увеличеният брой гени при тях. Броят на структурните гени при прокариотите е около 1-4х10³, докато при еукариотните организми е около 1-2х10⁵. Една от причините за твърде голямото количество на ДНК при еукариотите е наличието на така наречените спящи гени (silent genes), които отговарят за специфични извънредни програми в клетката. Друга особеност на еукариотният геном е неговата относителна нестабилност, дължаща се на наличието на гени с непостоянна локализация – скачащи гени (jumping genes). Показател за пластичността на генома при еукариотните организми е амплификацията не само на рибозомните гени, но и на структурните гени, кодиращи някои белтъчини, в т.ч. и ензими.

Бактериалната, плазмидната и фагова ДНК е изградена от уникални подреждания на нуклеотидите по нейната дължина. При еукариотните клетки обаче ДНК е силно диференцирана по дължината си. Наред с уникалните подреждания (еднократно срещащи се) се откриват и подреждания, които се срещат по няколко пъти (умерено повтарящи се) и трети тип подреждания, които се повтарят хиледи пъти (многократно повтарящи се). При повечето бозайници уникалните подреждания представляват от 60 до 75% от общото количество ДНК в клетката. Това са гените отговорни за синтезата на основните белтъчини в организма. Умерено повтарящите се нуклеотидни последователности са поместени между уникалните подреждания. Обикновено по дължината на хромозомата се наблюдават последователности, редуващи уникално подреждане с умерено повтарящ се участък. Пример за такива умерено повтарящи се участъци може да се даде с полимерните гени, които кодират повечето количествени признаци – млечност, масленост, вълнодайност и т.н. Умерено повтарящите се последователности са групирани в блокове разделени от спейсери. Към тях се отнасят гените, които кодират биосинтезата при рибозомните РНК. В съответствие с константата на седиментация те се делят на 28 s, 18 s и 5 s рРНК. Гените за 28 s и 18 s рРНК се повтарят в района на прищъпването на хромозомата в областта на организатора на ядърцето, а гените кодиращи 5s рРНК се разполагат по дългите рамена на хромозомите. Значителна част от генома на еукариотите се заема от умерено повтарящи се нуклеотидни последователности. Резултатите от проекта „Човешки геном“ доказаха, че там са разположени голяма част от регулаторните гени на клетките.

Предполага се, че третият вид подреждания – многократно повтарящите се са възникнали вследствие изменения в структурата на ДНК. Обикновено те са съставени от последователност от 6 нуклеотида (хексамери) – TTTTTC/AAAAAG. При различните организми нуклеотидите имат известни различия, но винаги са сравнително къси вериги. Този тип нуклеотидни подреждания понякога се повтарят милиони пъти в генома на организма. Такива подреждания са открити в района на центромера, в теломерите, в сателитите на някои хромозоми. Тези подреждания изграждат биологично неактивният конституитивен хетерохроматин, защото те не носят генетична информация за синтез на каквито и да било белтъчини.

В генома на еукариотите съществуват и още един тип многократно повтарящи се подреждания съставени само от двойката Аденин – Тимин. Те кодират синтезата на къси поли аденин вериги, които обикновено са с дължина около 150-200 нуклеотида. Те са от особено значение при процеса транскрипция, където се закачват към 3' – края на синтезираната верига.

Както вече споменахме всяка молекула ДНК при еукариотите е обособена в отделна хромозома, като броят на хромозомите при конкретният вид отговаря на броят молекули ДНК които се съдържат в неговият геном. При висшите организми всяка хромозома има свой хомолог – единият получен от яйцеклетката, а другият от сперматозоида участвали в създаването на организма. Така при висшите организми всеки ген има свой хомолог, а общият хромозомен набор бележим с 2n. При прокариотите наследствената информация се съдържа в една молекула ДНК, т.е. генетичният материал е представен от едно единствено копие.

Денaтурация на ДНК

При процесите на презаписване (репликация) и експресия на гените (транскрипция) се наблюдава явление много характерно за двойноверижната ДНК молекула – двете вериги се разделят. Процесът се нарича денатурация и при нормални условия е обратим. Обратното свързване на изходните вериги се извършва на принципа на комплементарността и се обозначава като ренатурация. In vivo двата процеса се извършват с голяма скорост, която е необходима за изпълнението на генетичните функции.

При in vitro среда, денатурация най-лесно се предизвиква посредством подлагане на молекулата на висока температура или много висока солева концентрация. При термичната денатурация настъпва разкъсване на всички водородни връзки между двете вериги без да се засягат ковалентните фосфодиестерни връзки. Тази особеност на термичната денатурация се използва при амплификацията на определени участъци от ДНК в in vitro среда. Процесът е известен като полимеразна верижна реакция (PCR) и е в основата на повечето съвременни ДНК анализи.

Денатурацията на ДНК се извършва в определен температурен диапазон. Средната точка на този диапазон се бележи като температура на топене (Tm-melting temperature). Разделянето на двете вериги се извършва при около 90°С. При надвишаване на температурата над 95°С има опасност от разпадане на единичните вериги, което е необратим процес.

Денатурацията зависи от:

• Нуклеотидният състав на изследваната молекула ДНК. При описването на структурата на ДНК описахме, че връзките между нуклеотидите Гуанин и Цитозин са тройни, а тези между Аденин и Тимин са двойни и в зависимост от превеса на една от двойките температурата на топене ще бъде по-висока или по-ниска. При повечето бозайници съотношението между тези двойки е 40/60 в полза на двойката Аденин – Тимин, поради което температурата на топене при тях е около 87°С. При видове, при които това съотношение е в полза на двойката Гуанин – Цитозин, температурата на топене достига 95°С.
• Солевото съдържание и йонната сила на разтвора - Тm нараства с 16.6°С  при  всяко увеличение на концентрацията на едновалентните йони.
• Наличието или осъствието на определени химични субстанции. Пример може да бъде даден с формамида, който дестабилизира водородните връзки и при наличието му в изследваният разтвор температурата на топене може да падне под 40°С.

Ренатурация

При използването на висока температура като денатуриращ фактор при възвръщане на изходната температура двете вериги се съединяват обратно благодарение на своята комплементарност. Процесът се обозначава като ренатурация или реасоциация. Ренатурацията се извършва двуетапно. Първоначално двете вериги се срещат на случаен принцип и образуват къси двойноверижни участъци, след което следва бурно образуване на водородни връзки по продължение на веригата. След свързването на всички участъци от двете вериги молекулата възстановява всички познати физични свойства изгубени при денатурацията.

Хибридизация

По същество хибридизацията е процес на ренатурация на предварително денатурирани ДНК молекули, произхождащи от  два различни вида или индивида. Така се образува хибридна структура и когато някои участъци са комплементарни те се свързват, докато други остават несвързани по между си. Несвързаните участъци се наричат хетеродуплекси и представляват участъци, които са се променили в процеса на еволюцията на организмите и отразяват различията между видовете. Посредством този своеобразен тест бихме могли да разберем каква е степента на сходство между веригите, които изследваме, а от там косвено да съдим за сходството между организмите. Колкото повече комплементарни участъци има между двете вериги, толкова по-близки еволюционно са изследваните видове. Благодарение на този похват са установени сходствата между различни организми населяващи нашата планета и е доказан техният общ произход. Така например е доказано, че ДНК на мишка е по-хомоложна с ДНК на плъх, отколкото с ДНК на човек.

Въпроси за самоподготовка!

Базите в срещуположните вериги на ДНК са свързани по между си посредством:

1. Ковалентна връзка
2. Пептидна връзка
3. Фосфодиестерна връзка
4. Нековалентна връзка
5. Водородна връзка

Правилото на Ъруин Чаргаф гласи:

1. Съотношението между фосфора и хлора в молекулата на ДНК е 1:1
2. Съотношението между пуриновите и хиперпуриновите бази е 1:1
3. Съотношението между пуриновите и пиримидиновите бази е 1:1
4. Съотношението между ДНК и РНК в клетката е 1:1

Суперспирализацията бива:

1. Положителна и отрицателна
2. Права и обратна
3. Силна и слаба
4. Единична и множествена

Генетичният код е:

1. Универсален за всички организми на планетата Земя
2. Уникален за всеки отделен вид
3. Различен при прокариотите и еукариотите

Денатурацията на ДНК зависи от:

1. Нуклеотидният състав на изследваната молекула ДНК
2. Солевото съдържание и йонната сила на разтвора
3. Наличието или осъствието на определени химични субстанции
4. Всички са верни
5. Няма верен отговор

Ренатурацията на ДНК зависи от:

1. Нуклеотидният състав на изследваната молекула ДНК
2. Солевото съдържание и йонната сила на разтвора
3. Наличието или осъствието на определени химични субстанции
4. Всички са верни
5. Няма верен отговор