2. РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК

Приемствеността между поколенията и установяването на механизмите, които я обуславят е едно от най-вълнуващите открития в биологията. След доказване ролята на молелулата на ДНК като нисител на наследствената информация се задава въпросът:  Как се самовъзпроизвежда тази молекула и как се предава от поколение на поколение? След доказването на двойноспиралната структура на ДНК Уотсън и Крик предлагат и модел по който молекулата се „размножава“. По техните предположения двойната спирала се разплита и всяка една от веригите служи като матрица за синтез на нова комплементарна молекула. В последствие всяка нова двойноверижна ДНК спирала е изградена от една новосинтезирана и една стара верига. Благодарение на проницателността на тези двама изследователи (работещи предимно с молекулни модели) тези предположения били експериментално потвърдени.

 

1. Принцип на репликацията

Теоретично са възможни два механизма за репликация на ДНК:

• Консервативен – предполага се, че след разделянето на двойната верига всяка от веригите служи като матрица за синтез на нова верига. В края на процеса получените две двойни вериги се разделят като изходните „матрици се съединяват (сглобяват) и възвръщат изходната „майчина“ верига. От друга страна двете нови копия също се съединяват на принципа на комплементарността и оформят изцяло нова дъщерна верига ДНК. Този механизъм е бил първоначална хипотеза, но в последствие е бил отхвърлен.
• Полуконсервативен – след разделянето на родителската верига двете едноверижни молекули служат като матрица за синтез на нова комплементарна верига ДНК. След края на процеса се образуват две двойноверижни молекули, всяка от които съдържа една родителска и една дъщерна верига ДНК. След огромен брой експерименти е доказано, че репликацията на ДНК се извършва именно по полуконсервативният механизъм. Предполага се, че еволюционно клетката е предпочела този начин на репликация, тъй като той не изисква допълнително разделяне на веригите и прегрупирането им.

 

2. Точка на инициация и посока на репликацията

Молекулата на ДНК се среща в две основни форми:

• Линейна – при еукариотите. 
• Кръгова – при бактериите, някои фаги и вируси, плазмидите и др. 

И при двете форми репликацията винаги започва от точно определено място на веригата означавано като точка на инициация. При кръговите молекули се наблюдава наличието на едно такова място докато при линейните ДНК молекули се наблюдават множество начала на репликацията. Инициацията на репликацията започва от тези начални точки и се извършва в двете посоки, т.е. процесът е двупосочен. Структурата, която се образува в мястото на репликацията, се нарича репликативна вилка. Участъкът, който води началото си от една точка на инициация се нарича репликон, а краят на всеки репликон се бележи от мястото в което се срещнат две съседни репликативни вилки. Както вече описахме при еукариотите съществуват множество точки на инициация, което обяснява и огромният брой репликони (едновременно реплициращи се участъци) при тях. При повечето бактерии геномът е съсредоточен в една кръгла молекула при която се открива само една начална точка и репликацията при тях протича с един репликон. При тях репликативните вилки се срещат приблизително на 180° от началната точка поради приблизително еднаквата скорост на протичане на процеса в двете противоположни посоки на репликона.

 

3. Пространствена организация на ДНК и ензими, участващи в нейното поддържане

Предложените две форми на ДНК са идеализиран модел. В природата молекулите на ДНК нямат такива идеални форми. За да се поберат тези дълги молекули в клетките те се намират в така наречената суперспирализирана форма. Това важи както за кръговите така и за линейните форми на ДНК. Суперспирализацията на ДНК се осъществява посредством допълнителното завъртане (надясно) на двете дяснозавити вериги. При това допълнително завъртане около собствената си ос всяка кръгова молекула ДНК придобива линейна форма. Следователно наблюдавайки суперспирализирани молекули не бихме могли да предвидим тяхната форма.

При отрицателната суперспирализация двете вериги се завъртат в посока обратна на нормалната ДНК спирала, т.е. завиват се наляво. В резултат на това завъртане се получава разхлабване на двойната спирала и тя преминава в т. нар. релаксирано състояние. Броят на суперспирилните извивки зависи от броят на допълнителните положителни или отрицателни усуквания на молекулата. Суперспирализацията предизвиква изменение на формата на ДНК веригата като се получават молекули с една до няколко допълнителни извивки. Получените различни форми в резултат на суперспирализацията се наричат топоизомери. Както при повечето процеси в клетката и суперспирализацията е ензимен процес. Ензимите, които предизвикват това допълнително завиване се означават като топоизомерази. Те осъществяват тази своя функция чрез временно разкъсване на една от веригите и формирането на временна фосфодиестерна връзка между тирозинов остатък от ензима и единия от краищата на разкъсаната верига ДНК. След завъртането на веригите една около друга топоизомеразите лигират разкъсаните крайща. Като топоизомерази в клетката действат няколко ензима. Едни от тях предизвикват разкъсване на само една от веригите (клас I топоизомерази), докато други предизвикват разкъсването и на двете вериги (клас II топоизомерази).

 В процеса на репликацията двете вериги се разделят за да послужат като матрици за синтез на нови ДНК копия. При разделянето им обаче се намесват ензимите на суперспирализацията. Нормално ДНК е дяснозавита молекула в първите моменти се предизвиква отрицателна суперспирализация, което води до релаксиране на молекулата. В последствие спирализацията се задълбочава и се достига до момент, при който молекулата е толкова свръхспирализирана, че репликативната вилка се блокира. В този момент се намесват топоизомеразите и предизвикват отрицателна спирализация (наляво). По този начин молекулата придобива отново линейна форма и репликацията продължава.

 

4. Посока на нарастване на новосинтезираните вериги

Репликацията е ензимен процес осъществяван от ензими наричани ДНК зависими ДНК-полимерази. Те изграждат ковалентна 5’,3’-фофодиестерна връзка между отделните нуклеотиди, следейки за правилното комплементарно свързване спрямо изходната матрица. Субстрат и енергиен източник на процеса се явяват свободните нуклеозидтрифосфати в клетката.

Репликацията на ДНК винаги протича в посока от 5‘ края на веригата към нейният 3‘ край, поради което в клетката не се откриват ензими които имат способността да присъединяват нуклеотиди в обратната посока.

 

Синтезата на ДНК винаги протича в поска 5’>3’, т. е. това е посоката на нарастване на ново-ситезиращата се верига:

Двете вериги на ДНК са антипаралелни, т.е. ако едната верига завършва с 5‘край, то комплементарната на нея ще завършва с 3‘ край от същата страна. Изхождайки от правилото, че ДНК се синтезира в посока от 5‘ към 3‘ края на веригата бихме могли да си зададем въпроса: В каква посока нарастват двете вериги в репликативната вилка? Ако се придържаме към правилото за синтезата на ДНК това би било невъзможно? Отговорът на този въпрос се крие в един интересен феномен. Както по-горе описахме репликацията на ДНК се стартира от няколко начала като в последствие всяко начало се превръща в отделен репликон. Установено е, че репликацията на едната верига започва и протича от едно начало (без прекъсване), защото тя притежава 5‘ край, от който процесът може да започне. Тази верига се отбелязва като водеща. Комплементарната верига обаче завършва с 3‘ край и процесът не може да започне от този край. При тази верига се наблюдават много точки на инициация (начала), от които започва синтезата на комплементарни малки вериги ДНК с посока от 5‘ към 3‘. Отделните фрагменти, при които се синтезират нови комплементарни вериги са наречени на името на техният откривател – фрагменти на Оказаки. Тъй като процесът при тази верига се извършва по-бавно в сравнение с водещата тя е наречена изоставаща верига. При удължаването на всеки отделен фрагмент рано или късно се застига друга начална точка (друг фрагмент). Свързването между двата фрагмента на Оказаки се извършва с помощта на лигазите. Тези ензими изграждат ковалентна връзка между хидроксилната група на 3‘ края на единият фрагмент и 5‘фосфатната група от началото на следващият фрагмент. По този начин в края на процеса и двете дъщерни вериги придобиват цялостен (нефрагментиран) вид.

За инициацията на репликацията освен синтезиращ ензим (ДНК полимераза) е нужен и малък фрагмент (ДНК или РНК) наречен праймър. Към този къс участък в последствие се присъединяват новите нуклеотиди комплементарни на изходната верига.

Обикновено при репликацията ролята на праймър се изпълнява от къси РНК фрагменти, което от своя страна обяснява и участието на РНК полимеразите в началният етап на репликацията. РНК полимеразите са полимеризиращи ензими, но не се нуждаят от праймър за да започнат синтезата. В края на репликацията в новосинтезираната верига не се откриват рибонуклеотиди, което означава, че по някакъв начин те се отстраняват както от водещата, така и от отделните фрагменти на Оказаки на изоставащата верига.

 

5. Белтъци, осигуряващи едноверижните ДНК матрици

В процеса на репликацията участие вземат няколко групи ензими. Както вече посочихме топоизомеразите намаляват напрежението пред репликативната вилка, а ДНК и РНК полимеразите присъединяват свободните нуклеозидтрифосфати към новосинтезиращата се верига. Участие в репликацията вземат и две други групи белтъци:

• Хеликази – спомагат за по-бързото разрушаване на водородните връзки между двете вериги на майчината верига ДНК. Те имат свойството да се свързват с едноверижните участъци в началото на репликативната вилка и използвайки енергията от аденозинтрифосфатите (АТФ) разрушават водородните връзки между двете вериги на ДНК. При бактерията E. coli са открити две хеликази. Едната се свързва към изоставащата верига и се движи в същата посока по която тече репликацията (5‘-3‘). Другата хеликаза (Rep-белтък) се свързва към водещата верига и се движи в посока обратна на посоката на репликацията (3’>5’)
• Белтъци, свързващи едноверижна ДНК – имат свойството да покриват „оголените“ едноверижни участъци от ДНК (под действието на хеликазите), като по този начин предотвратяват обратното им свързване. Тези белтъци при E.coli са изградени от 177 аминокиселини и покриват участък от 32 нуклеотида от ДНК. Характерно за тях е, че при свързването на такъв белтък в един участък инициира свързването на белтъците и със съседни участъци. Това явление е описано като кооперативно свързване.   

 

6. Ензими участващи в процеса на репликация

Както вече описахме, в началото на процеса репликазия се намесва ензимът РНК полимераза, който синтезира къси вериги от РНК (праймър). Тези вериги се захващат за началата разположени по ДНК веригата и ензимът ДНК полимераза започва да синтезира нова верига. Поради различията им с РНК полимеразите, участващи при транскрипцията на гените РНК полимеразите, синтезиращи праймър се означават с името примази. При бактерията Е. coli примазата представлява полипептид, активиращ се само в присъствието на няколко други полипептида. Комплексът от примазата и допълнителните белтъчини се означава като примозома. Примозомата изпълнява следните функции:

1. Разпознава точките на инициация по дължината на ДНК веригата.
2. Полимеризация на рибонуклеотиди и превръщането им в праймър.
3. Изместване на покривните белтъчини от едноверижните ДНК вериги.
4. Придвижване по дължината на репликативната вилка.

Бихме могли да кажем, че всички описани до момента ензими имат спомагателна роля в процеса на репликацията. Същинско значение за репликацията имат ДНК-полимеразите. При бактерията Е. coli се откриват три вида ДНК полимерази – ДНК полимераз I, ДНК полимераза II и ДНК полимераза III. Както вече се запознахме всички ДНК полимерази имат свойството да синтезират нови ДНК вериги, но изискват наличието на ДНК или РНК олигонуклеотиди (праймър) от които да стартират. Най-важна роля при репликацията играят ензимите ДНК полимераза I и III. Ензимът ДНК полимераза III е отговорен за синтезата на ДНК, както във водещата верига, така и във фрагментите на Оказаки. За да изпълнява тази си функция той притежава 5’>3’ активност. Установена е и така наречената редактираща активност на този ензим, изразяваща се в отстраняване на погрешно включени нуклеотиди. Тази функция (екзонуклеазна активност) се обуславя от 3’>5’ активността на ензима, което му позволява да замества неправилно включените нуклеотиди при синтезата на ДНК. Въпреки сравнително малкият брой на допусканите грешки при репликацията редакционната способност на ДНК полимераза III дава допълнителна точност на процеса. ДНК полимераза III е изградена от десет различни полипептидни вериги. Основната част от тях съставят така нареченият кор ензим съставен от три субединици. Едната субединица притежава 5’>3’ екзонуклеазна и полимеразна активност. Редактиращата способност на ензима се определя от определя от друга субединица на кор ензима, притежаваща 3’>5’ екзонуклеазна активност. Описаният ензим се открива в около 20 копия в клетката като при започване на репликацията той се закрепва за верига ДНК и не се отделя от нея докато не достигне краят и.

Функциите на ДНК полимераза I са основни три:

- Разграждане на праймъра от който започва репликацията, използвайки 5’>3’-екзонуклеазната си активност.

- Запълване на образуваната празнина (от отстраненият праймър) с комплементарни нуклеотиди. При този процес ензима използва 5’>3’-полимеризиращата си активност и добавя нуклеотиди към 3’-ОН-края на предходния фрагмент на Оказаки.

- Проверява и отстранява погрешно включените нуклеотиди (дублира функцията на ДНК полимераза III).

Този ензим се намира в по големи количества в клетката (400 копия) като освен при репликацията участва и в процесите на репарация и рекомбинация на ДНК.

           След запълването на празнината от отстранения праймър и доближаването на двата фрагмента на Оказаки двата края се свързват в една обща верига. Свързването на крайщата на два съседни фрагмента се извършва от ензима ДНК лигаза, която образува ковалентна връзка между 3’-ОН-края на единия фрагмент на Оказаки и 5’-Ф-края на следващия. 

Комплексът от всички белтъчини, вземащи участие в процесът на репликацията се обозначават с общото име реплизома.

 

Етапи на репликацията

Репликацията на ДНК може да бъде разделена на три основни етапа:

1. Инициация

Както вече описахме началото на репликацията при водещата верига започва от едно място, докато при изоставащата верига от няколко места, които в последствие формират фрагментите на Оказаки. Практически точките на инициация са местата в които се формират репликативните вилки. При прокариотните организми генома най-често е съсредоточен в една кръгова молекула ДНК и при тях точката на инициация е една. От тази точка в двете посоки се оформят по една репликативна вилка. При E. coli началото на репликацията е участък съставен от 245 нуклеотидни двойки. Предполага се, че тези нуклеотиди се разпознават от ензимите и белтъците участващи в инициацията на репликацията в следствие на което процесът стартира. Такива белтъчини са: dna A; dnaC-polD, dnaH, dnaI и dnaP. Решаващо значение за инициацията има формирането на репликативната вилка и започването на синтезата на водещата верига. На по-късен етап стартира и синтезата на изоставащата верига. Първоначално се синтезират къси РНК вериги, които служат като праймър за водещите вериги.

2. Елонгация

Удължаването на полинуклеотидната верига се регулира от всички описани в предходният раздел ензими. Разкъсването на водородните връзки се осъществява от ензима хеликаза, след което покриващите белтъчини покриват едноверижните разклонения за да ги предпазят от ендонуклеазите в клетката. В последствие синтезата на веригата се извършва от ензима ДНК полимераза III, който измества праймъра и започва да присъединява нуклеотиди комплементарни на майчината верига. На по-късен етап ензимът ДНК полимераза I запълва празното пространство образувано от отстраненият праймър и заменя неправилно включените нуклеотиди, а ДНК лигазата свързва крайщата на двата съседни фрагмента на Оказаки. Така първоначално разделената нова верига придобива завършен вид.

3. Терминация

Въпреки мащабните проучвания все още не са установени специфични ДНК последователности, които да провокират спирането на репликацията. Експериментално това е доказано посредством отстраняване на участъците ДНК (при кръгова ДНК репликативните вилки се срещат на 180° от началото на репликацията), в които нормално се срещат двете срещуположни репликативни вилки. Подобни делеции не възпрепятстват терминацията на репликацията.

 

Типове репликация

В зависимост от морфологията на молекулата, която ще се удвоява съществуват следните типове репликация:

1. Репликация тип Око (тета репликация)

Тази репликация се извършва при линейни молекули ДНК. Точката на инициация е приблизително в средата на молекулата, при което се разплита двойната спирала и в двете посоки започват да се синтезират нови ДНК вериги. Както вече описахме при започването на репликацията двете вериги не се разплитат изцяло, а само в участъкът на инициацията. При синтезата на нови вериги в двете посоки се образува структура, при която в двата края се намират все още неразплетените майчини вериги, а в средата се откриват две двойноверижни молекули, при които процесът вече е протекъл. Тази структура може да се наблюдава под електронен микроскоп и се нарича „Око“. При продължаването на процеса големината на получилият се мехур нараства и постепенно се приближава към двата края на майчината верига. Тъй като точката на инициация не е точно в средата на веригата мехурът достига по-бързо единият край на веригата отколкото другия.  При наблюдение под микроскоп се вижда Y-подобна структура. При продължаването на процеса към другият край на веригата малко по-късно се наблюдава V-подобна структура. При приключването на репликацията от линейната родителска верига се получават две двойноверижни дъщерни молекули, всяка носеща по една родителска и една новосинтезирана молекула.

2. Репликация тип Търкалящ се пръстен (сигма репликация, rolling circle)

Този тип репликация е свойствен за пръстеновидните ДНК молекули. Процесът стартира с разкъсването на фосфодиестерните връзки в определен участък от едната верига. Такава едноверижна дупчица на мястото на една фосфодиестерна връзка се означава като ник (nick) и води до образуването на 3’OH и 5’PO₄ краища в тази верига.  Другата верига запазва пръстеновидната си форма. Към 3’OH края на срязаната верига се захваща ензимът ДНК-полимераза и започва да удължава веригата като избутва 5’PO₄ навън. Върху избутаният край на веригата веднага се прилепват покриващите белтъчини за да го предпазят от ендонуклеазите в клетката. Към избутаният 5‘ край се захваща друга молекула ДНК полимераза, която започва да изгражда нова верига в посока 5‘>3‘. Освободената едноверижна опашка се реплицира по известния механизъм чрез образуването на фрагменти на Оказаки, а водещата верига се синтезира върху интактната кръгова матрица и непрекъснато доставя матрицата на изоставащата верига.  При постепенното нарастване на веригите се получава σ-подобна структура откъдето този тип репликация носи и името си. При завършването на репликацията се образуват две двойноверижни дъщерни вериги, едната с кръгова форма, а другата с линейна. Този тип репликация е характерен за някои бактериофаги и вируси.

3. Репрликация тип D-бримка

Геномите на органелите имат интересна особеност: двете вериги на тяхната ДНК имат различни и неравностойни начала на репликация. Репликацията при тях се извършва по специфичен начин известен като D-бримка. Синтезата на нови молекули ДНК стартира от веригата, съдържаща по-активното начало като новосинтезираната ДНК молекула измества старата допълнителна верига. процесът би могъл да се оприличи на репликация тип търкалящ се пръстен, но тук двете вериги запазват кръговата си форма. Друга отличителна черта на репликацията тип D-бримка е, че в изоставащата верига не се образуват фрагменти на Оказаки, а процесът ротича без прекъсвания.

4. Репликация на едноверижни кръгови геноми

Наследствената информация на някои бактериофаги е разположена в едноверижна кръгова ДНК молекула. След навлизането им в бактериалната клетка едноверижната фагова ДНК почти изцяло се покрива с покривни белтъчини. Непокрита остава само една малка част, където се синтезира РНК праймър необходим за започване на репликацията. Процесът продължава със синтез на нова верига (ензим ДНК полимераза III), отстраняване на РНК праймъра (ДНК полимераза I) и формиране на ковалентна връзка между двата края на новосинтезираната верига (ДНК лигаза). Получената двойноверижна кръгова молекула се обозначава като репликативна форма. От тук на татък процесът продължава по вече описаният механизъм на въртящото се колело. 

5. Еднопосочна репликация на двойноверижни линейни фагови геноми без използването на РНК-праймери

Геномът на някои бактериофаги е базиран на линейни двойноверижни ДНК молекули и репликацията при тях протича без използването на РНК праймер. Репликацията при тях започва в единият край (независимо кой) на линейната молекула и се реплицира само едната верига. При синтезирането на молекулата тя постепенно избутва едната родителска верига. Краищата на избутаната едноверижна молекула взаимодействат и формират структура подобна на фуркет (стебло и бримка). В двойноверижният участък на фуркета се захваща друга ДНК полимераза III и започва синтезата на комплементарна верига. При преминаването на ензима по дължината на фуркета той се разрушава и на края на процеса се образува ново копие двойноверижна линейна ДНК.

Въпроси за самоподготовка!

Механизмът за репликация на ДНК се означава като:

1. Консервативен
2. Полуконсервативен
3. Уникален
4. Специфичен

Топоизомеразите от клас I предизвикват:

1. Разкъсване на една от двете вериги на ДНК
2. Разкъсват и двете вериги на ДНК
3. Разкъсват хромозомите при деленето на клетката
4. Разкъсват ядрената мембрана

Репликацията на ДНК протича в посока:

1. 5’>3’
2. 3’>5’
3. И в двете посоки
4. Друго (моля посочете)

Примозомата изпълнява следните функции:

1. Разпознава точките на инициация по дължината на ДНК веригата.
2. Полимеризация на рибонуклеотиди и превръщането им в праймър.
3. Изместване на покривните белтъчини от едноверижните ДНК вериги.
4. Придвижване по дължината на репликативната вилка.
5. Всички посочени отговори
6. Нито един от посочените отговори

В зависимост от морфологията на молекулата която ще се удвоява, репликацията може да бъде (верните отговори са повече от един):

1. Тета репликация
2. Търкалящ се пръстен
3. Д-бримка
4. Права репликация
5. Обратна репликация