2. ЕКСПРЕСИЯ НА ГЕНИТЕ

Характерните белези за всеки вид се дължат на специфичните белтъчини синтезирани в неговите клетки. Генната експресия се състои в преносът на наследствената информация кодирана от гените разположени в ДНК до рибозомите (органелите отговорни за белтъчната синтеза). Гените се делят на две основни групи в зависимост от природата на крайния продукт:

• Рибозомни гени и гени кодиращи тРНК – кодират синтезата на рРНК и тРНК
• Структурни гени – кодират всички белтъчни молекули в клетката. За превеждането на наследствената информация от тези гени до езика на белтъчините информацията преминава през молекула посредник – иРНК.

 

Транскрипция и етапи на транскрипцията

Както се вижда при експресията на всички гени (независимо от по-горе представеното разделение) се синтезират РНК молекули. Процесът на презаписване на наследствената информация от гените разположени в ДНК в молекули РНК (иРНК, рРНК и тРНК) се нарича транскрипция. По подобие на репликацията транскрипцията също е матричен процес (протичащ в посока от 5‘>3‘), който условно може да бъде разделен на три основни етапа:

1. Инициация на транскрипцията. Синтезата на иРНК се осъществява от специфичен ензим – РНК полимераза (наричан до скоро ДНК зависима РНК полимераза). РНК полимеразата се състои от 5 субединици – (α2ββ)σ. Заградената в скобите част се означава като кор ензим. Ролята на σ-субединицата се състои в разпознаването на точките на инициация на транскрипцията във всеки определен ген. При отсъствие на σ-субединицата кор ензима стартира синтезата на РНК в случайни места от веригата на ДНК, поради което се допускат грешки в презаписването на информацията. Това означава, че σ –субединицата придава на ензима способността да разпознава и да се свързва специфично с области (промотори) пред гена, от които зависи точността на неговото презаписване. При изследвания върху бактерията E. coli е установено, че повечето нейни гени съдържат промоторни области от шест нуклеотидни последователности разположени на разстояние между 35 и 10 базови двойки пред точката на инициация. Тези шест нуклеотидни последователности в гените се означават като боксове и в повечето случаи тяхната последователност е TATAAT (-10) и TTГAЦA (-35). При мутация в някой от двата бокса настъпват сериозни отклонения в инициацията на транскрипцията. Всички процеси от намирането на промотора от РНК полимеразата до започването на самата синтеза на РНК се означават като инициация на транскрипцията. След като полимеразата открие промотора тя се свързва с него в шест нуклеотидната последователност при позиция -35. В този момент двойната спирала на ДНК не е разделена и заедно с полимеразата образуват „затворен“ комплекс. След това този затворен комплекс преминава  в “отворен”, при което се разплита (локална денатурация) участък в ДНК от около 17 базови двойки с начало в шест-нуклеотидната област от позиция –10. При преминаването от затворен в отворен комплекс полимеразата се свързва много силно с веригата на ДНК, което гарантира протичането на процеса. Участъкът от промотора в позиция -10 попада в разплетената зона, което обяснява наличието на нуклеотидите аденин и тимин. Както описахме в разделът за структурата на ДНК връзките между аденин и тимин са двойни, а между гуанин и цитозин - тройни. За преминаването на ДНК от двуверижно в едноверижно състояние е необходимо връзките между двете вериги да бъдат разкъсани. Поради по-малкият брой връзки между аденин и тимин ДНК веригите се разединяват именно в тези области. При образуването на отворения комплекс първият нуклеотид от гена (+1) попада в едноверижната област, т. е. матрицата нужна за синтезата на РНК вече е отворена и готова за протичане на процеса. При повечето бактериални РНК първият нуклеотид от веригата е аденин или гуанин с три фосфатни групи в началото (фффА или фффГ). Началото на синтезата не е строго фиксирано и се предполага, че РНК полимеразата сканира областта пред себе си до намирането на пуринов нуклеотид (аденин или гуанин). Характерно за РНК молекулите е, че те не запазват първоначалният си 5‘ краен нуклеотид, което ги предпазва от атака на нуклеазите в клетката.
2. Елонгация на транскрипцията (прибавяне на рибонуклеотидфосфатите). Както вече описахме, при отвореният комплекс връзката между РНК полимеразата и едноверижната молекула ДНК е много силна, което пречи на придвижването на ензима. Затова през този етап σ-субединицата на РНК-полимеразата се отделя от сърцевината на ензима, което спомага по-лесното преминаване на ензима по ДНК матрицата. При придвижването на РНК-полимеразата по ДНК-матрицата отвореният комплекс се премества по посока синтезата на РНК, а дължината му от около 17 базови двойки се запазва. Около 5 от нуклеотидите остават свободни, а останалите 12 преминават в хибридно състояние с новосинтезиращата се иРНК. Частта от ДНК веригата, при която процесът вече е протекъл възстановява двойноверижната си структура. Удължаването на полинуклеотидната РНК молекула се извършва посредством присъединяване на нови нуклеотиди в посока към 3‘ края на матрицата.

След отделянето на σ-субединицата към кор ензима се присъединява специфичен белтък наречен NusA-белтък. Предполага се, че този белтък придава по-добра свързаност на ензима към веригата, но силата на връзката е по-слаба отколкото в наличието на σ-субединицата.

3. Терминация на транскрипцията. Завършването на транскрипцията се характеризира с отделянето на синтезираната иРНК от ДНК матрицата. Доказано е, че ДНК веригата съдържа специфични последователности, които оказват прекратяването на процеса. Обикновено тези участъци се характеризират с палиндрома и наличието на определен брой аденилови остатъци. При достигане на такъв участък полимеразата рязко намалява скоростта на придвижването си и постепенно се отделя от ДНК веригата.

Транскрипция при еукариоти

Транскрипция под контрола на РНК-полимераза ІІ

Начала на транскрипция от Pol II

Както вече описахме РНК полимеразите могат да започнат синтеза на ДНК в отсъствието на праймер (РНК олигонуклеотид). Обикновено първият разпознат от тях нуклеотид от ДНК матрицата е под формата на 5’-трифосфат. При прокариотите този 5‘ край на иРНК е атакуван от рибонуклеазите в клетката, поради което при тях се открива 5‘ монофосфат. Характерно за иРНК при еукариотите е изграждането на кеп структура на техният 5‘ край, катализиран ензим, разпознаващ за субстрат 5‘ три или дифосфат. Този факт потвърждава, че мястото на започване синтезата на иРНК съвпада 5‘ кеп края на иРНК(изграден от РНК полимераза II).

 

Промотори на РНК-полимераза II

Ензимът РНК полимераза II е отговорен за транскрипцията, както на гените кодиращи структурните белтъци, така и за гените кодиращи малките ядрени иРНК. В повечето случаи промоторните зони на този ензим се намират извън областта, която ще подлежи на транскрипция. Определени участъци в промоторните последователности са строго специфични за различните организми, което показва липса на коеволюция при тези структури. Съществуват и участъци в промоторите, които са хомоложни при различните видове. Пример за такъв участък е така нареченият ТАТА-бокс, разположен на позиция -25. Този бокс (аналогично с бокс -10 при бактериите) има значение за точното разпознаване на първият нуклеотид за транскрибиране (+1). Също както описахме при бактериите така и тук, в повечето случаи първият включен нуклеотид от РНК полимераза II е с пуринова база, след което на 5‘края се синтезира кеп структурата. При някои еукариоти вместо ТАТА бокс се открива наличие на цитозин на позиция -1 и аденин на позиция +1. Тази особеност формира алтернативен промоторен елемент. Нуклеотидните последователности в близост до тези структури имат съществено влияние за правилното функциониране на този тип промотори. При гените, при които се откриват ТАТА бокс или горепосоченият инициаторен елемент транскрипцията стартира от точно определен нуклеотид. При други гени обаче процесът може да стартира от различни участъци. В промоторните области на такива гени са открити така наречените ЦГ-островчета (участъци от нуклеотиди съдържащи само цитозин и гуанин).

Описаните три вида промотори отговарят за точното разпознаване на първият нуклеотид (+1), от който да стартира транскрипцията, но пред тях (на растояние до 200 базови двойки) се откриват допълнителни регулатори на транскрипцията. Разположението на тези регулатори (проксимални елементи) не е строго специфично, както бе описано за бокс -35 при прокариотите. Пример за такава последователност е  ЦЦAATТ. Такъв участък, разположен пред ТАТА бокса е установен при много видове и може да бъде разположен и в двете вериги на ДНК матрицата.

Формиране на пре-инициационен комплекс (ПИК)

ПИК е съставен от РНК полимераза II и следните щест транскрипционни фактора (TF) - TFIIA, TFIIB, TFIID,TFIIE, TFIIF и TFIIH. През първият етап от формирането на ПИК, TFIID се свързва с TFIIA. Транскрипционният фактор IIB е изграден от 12 субединици, една от които е белтъкът, който се свързва с ТАТА бокса. Именно този белтък открива ТАТА бокса и инициира формирането на ПИК. В следващият етап към комплекса се присъединява и мономерният белтък TFIIB като неговият С-край създава връзка с ДНК матрицата. Малко по-късно към комплекса се включват TFIIF и Pol II. Завършването на инициаторният комплекс се постига с присъединяването на TFIIE и TFIIН.

Елонгация на транскрипцията

Както при прокариотите така и тук първоначално е необходимо двете вериги на ДНК да бъдат разделени една от друга в място близко до транскрипционното начало. В последствие полимеразата се отделя от ПИК като на тази стъпка TFIIВ, TFIIЕ и  TFIIН се отделят от комплека. Това допринася за по-лесното придвижване на ензима по ДНК веригата.

За разлика от прокариотите, при еукариотите ДНК е под формата на хроматин, което допълнително усложнява придвижването на полимеразата по матрицата. Сложният строеж на ПИК има значение за регулацията на инициацията, но повечето от компонентите му нямат каталитична функция. Характерно за еукариотите е, че след като полимеразата напусне ПИК, на нейно място може да постъпи нова полимераза, която да влезе в контакт с инициатора. По тази причина всеки следващ цикъл на транскрипцията се извършва по-бързо отколкото първият. При прокариотите описахме случаи, при които полимеразата „засяда“ по време на транскрипцията и процеса се блокира. Подобен феномен е наблюдаван и при еукариотите. В еукариотните организми съществуват специфични протеини отговорни за високотемпературен стрес, които се обозначават като топлинно-шокови протеини. Бързата експресия на гените отговорни за тяхната синтеза е жизненоважно при рязко повишаване на температурата на околната среда. При тези гени е наблюдавано засядане на полимеразата след като са синтезирани около 25 базови двойки от гена. При бързо покачване на температурата обаче възникват сложни каскади от събития, които освобождават заседналата полимераза. Този механизъм позволява изключително бърза транскрипция и последваща транслация на тези важни гени.

Транскрипция под контрола на РНК-полимераза І

Ядрена локализация на рибозомната биогенеза

Рибозомите на еукариотните клетки се образуват в ядърцата. Ядърцата представляват немембранни ядрени субструктури формирани от дисталните участъци на някои хромозоми. В ядърцата са разполижени специфични ензими, отговарящи за синтезата и зреенето на предшествениците на рРНК до 18S,  5,8S и 28S рРНК. Рибозомните белтъчини се синтезират върху по-ранни поколения рибозоми (в цитоплазмата), след което се транспортират до ядърцето. Характерно за процеса на образуване на рибозомите е, че участват много белтъчини, които не се откриват в завършените рибозоми, защото те остават в ядрото за да катализират следващите цикли на рибозомната синтеза. Когато са почти завършени 40S и 60S рибозомните субединици се експортират в цитоплазмата, където към тях се присъединяват още няколко белтъка, което ги трансформира във функционални рибозоми. Транскрибирането на рибозомните гени се извършва от РНК полимераза I. Нуклеотидните последователности кодиращи 18S, 5,8S и 28S рРНК се транскрибират заедно в една обща молекула предшественик. Това позволява да се синтезират еквимоларни количества от горепосочените три рРНК молекули.

Tранскрипция под контрола на РНК-полимераза ІІІ

РНК полимераза III синтезира рибозомната 5S РНК, транспортните РНК и някои малки РНК молекули. Както знаем вирусите използват молекулните механизми на клетката хазяйн за синтез на собствените си белтъчини, като в повечето случаи вирусните гени се транскрибират от РНК полимераза III. Транскриптите на този ензим обикновено съдържат около 300 нуклеотида и никога не кодират някакъв белтък. Те изпълняват предимно структурна роля в белтък-синтезния комплекс на клетката. Характерно за тази полимераза е, че промоторните области са разположени не преди, а в самите кодиращи региони. Такива нуклеотидни последователности се означават като вътрешен промотор. Установено е, че гените отговорни за тРНК са разположени в два големи блока (блок А и Б), които са силно консервативни както при еукариотите, така и при прокариотите. Терминацията на транскрипцията от РНК полимераза III също се кодира от нуклеотиди разположени в транскрибиращата област. Обикновено това са последователности със съдържание на три или повече тимина предшествани от многократно повтарящи се двойки гуанин и цитозин.

Разлики в транскрипцията между еукариоти и прокариоти

При прокариотите факторите отговорни за транслацията имат мигновен достъп то транскриптите, докато при еукариотите транскриптите се подлагат на процесинг (зреене) и едва когато се превърнат зрели иРНК молекули се транспортират в цитоплазмата. Накратко разликите в транскрипцията при еукариоти и прокариоти се свеждат до:

• В транскрипцията при еукариотите участват три РНК полимерази.
• Разпознаването на промотора при еукариотите се осъщества от различни транскрипционни фактори (TF), докато при прокариотите участие взема само σ-фактора.
• Кондензацията на хроматина при еукариотите затруднява процеса многократно повече в сравнение с прокариотите.

СПЛАЙСИНГ и РЕДАКТИРАНЕ на РНК

След транскрипцията копието РНК е идентично с последователностите, намиращи се в ДНК матрицата. В него са открити последователности, които кодират специфични белтъчини – екзони и групи нуклеотиди, които не кодират полипептидни вериги – интрони. По тази причина този първоначален транскрипт е прието да се нарича пре-информационна РНК. Процесът на отстраняване на интроните и снаждане на екзоните в зряла иРНК се означава като зреене или сплайсинг. Характерно за процеса е изключително високата прецизност, тъй като евентуални грешки при съединяването на интроните биха довели до сериозни нарушения в рамката на транслацията и сформирането на крайният белтък. До скоро се смяташе, че един ген отговаря за синтезата на една полипептидна верига и това правило битуваше в продължение на десетки години. В наши дни е установено, че при процесинга на пре-информационната РНК е възможно в едни случаи да се изрежат едни интрони, а в други случаи същите интрони да бъдат запазени. Така един и същ участък от ДНК може да резултира в синтезата на различни белтъчини. Тези различия в зреенето на пре-иРНК се означават като алтернативен сплайсинг. Доказано е, че почти 60% от човешките гени се подлагат на алтернативен сплайсинг, което от своя страна означава, че вариантите на един ген могат да са един, два или дори хиляди. По дължината на пре-иРНК са разпоожени специфични участъци, които оказват границата между екзоните и интроните. Границата между 5‘края на един интрон и предходният екзон се означава като 5‘ място за сплайсинг, а между 3‘ края на интрона и следващият го екзон – 3‘място за сплайсинг.

Механизъм на спалйсинга

При сплайсингът първоначално се разкъсват фосфодиестерните връзки между екзон и интрон, а след отстраняването на интрона връзките между двата доближени екзона се образуват отново. При двете реакции на трансестерификация не настъпва промяна в броят на фосфодиестерните връзки, а се променя тяхното местоположение. Разкъсването и сформирането на връзките не изисква енергия, но за сформирането и действието на апарата за сплайсинг са необходими големи количества АТФ. При обикновеният сплайсинг на границата между 5‘края на един интрон и 3‘ края на предходният екзон се разкъсват. На другият край на същият интрон се разкъсва връзката между неговият 3‘ край и 5‘ края на следващият екзон. На следващият етап, след отделянето на интрона от веригата, 3‘края на първият екзон се свързва с 5‘края на следващият екзон.  При алтернативния сплайсинг обаче същата реакция може да доведе до свързване на 5’-екзона с отстоящи на по-далечно разстояние от него (несъседни) 3’-екзони. По този начин е възможно определен екзон да бъде прескочен, което да доведе до липса на определени аминокиселини в полипептидната верига. Съществува и една много рядка форма на сплайсинг – транс-сплайсинг. При нея е възможно свързването на два екзона, принадлежащи към различни пре-иРНК молекули. По този начин се получават хибридни иРНК, които кодират синтезата на несвойствени белтъчини за клетката.

Сплайсозома

Сплайсингът се извършва с помощта на молекулни комплекси наречени спайсозоми. Сплайсозомите са съставени от около 150 белтъка и 5 РНК молекули. РНК молекулите които участват в тази структура се означават като малки ядрени рибонуклеобелтъчни комплекси (snRNPs). През различните етапи от сплайсинга в комплекса постъпват или излизат различни snRNPs, което показва различната функция на всяка една от тях. Основните им функции са свързани с разпознаване 5‘мястото на сплайсинга, доближаване на тези места и катализация на процесите на разкъсване и свързване на фосфодиестерните връзки.

Автокаталитичен сплайсинг (селф-сплайсинг)

Освен сплайсингът с участието на сплайсозомите, съществува и т. нар. автокаталитичен сплайсинг (self-splicing), извършван с участието на автокаталитични интрони от група I и II. При този тип сплайсинг интроните придобиват специфична пространствена конформация и катализират своето изрязване от молекулата на пре-иРНК. В зависимост от структурата си и механизмът на сплайсинт автокаталитичните интрони се разделят на две основни групи. Автокаталитичните РНКи се означават като рибозими, което показва тяхното каталитично действие. Автокаталитичните интрони от група II осъществяват сплайсинга по механизмите на сплайсозомите. В процесите на сплайсинга участва различни видове белтъчини, които неутрализират отрицателните заряди на фосфатните групи (между два съседни екзона) и така спомагат сближаването им.

Избягването на грешките в сплайсинга се извършват основно по два начина:

• Както вече описахме в раздел транскрипция, основна роля в транскрипцията заема ензимът РНК полимераза II. Този ензим носи със себе си редица белтъчини, имащи отношение към сплайсинга. След като 5‘мястото на сплайсинга се транскрибира, CDT-опашката на РНК полимеразата натоварва върху него специфични компоненти, които след появата на 3‘ мястото на сплайсинг извършват процеса. Това показва, че сплайсингът се извършва преди да са се транскрибирали други 3‘места за сплайсинг във веригата. Характерно за сплайсинга е, че при него не се наблюдава последователност, както при репликацията и транскрипцията.
• Вторият основен механизъм дава предимство в разпознаването на места за сплайсинг на най-близко разположените места. Съществуват специфични SR белтъчини, които се свързват с екзонните инхенсери на сплайсинга. В последствие тези белтъчини взаимодействат с апарата на сплайсинга и го насочват към най-близко разположените места за сплайсинг. Извършвайки се между най-близко разположените места за сплайсинг, допуснатите грешки в процеса (прескачането на екзони) се свеждат до минимум.

 

ТРАНСЛАЦИЯ и етапи на транслацията

Крйният етап от експресията на даден ген се заключава в синтезата на специфичните белтъчини кодирани в нуклеотидната му последователност. Белтъчната синтеза е матричен процес, извършващ се в специфични клетъчни органели – рибозоми. Тъй като нуклеиновите киселини са изградени от нуклеотиди, а мономери на белтъчините са аминокиселините, то наследствената информация трябва да се „преведе“ на езика на белтъчините. Процесът се отличава с изключителна сложност като основна роля в него вземат иРНК и транспортните РНК, които пренасят различните аминокиселини до белтък синтетазният комплекс. От една страна ДНК е носител на наследствената информация, но тази информация кодира производството на белтъчини, изпълняващи различни функции в клетката. В същото време всички генетични процеси в клетката (репликация, репарация, транскрипция и др.) са под контрола на различни белтъчини. Това означава, че процесите между нуклеиновите киселини и белтъците са взаимно свързани и без активната роля на белтъците, наследствената информация би била неизползваема.

 

Роля на транспортните РНКи

Превеждането на наследствената информация от езика на аминокиселините на езика на белтъците се извършва от тРНК, които служат като адаптори в процеса на транслацията.

Зрялата молекула иРНК съдържа различен брой нуклеотиди, като всеки три последователно подредени нуклеотида формират един кодон, кодиращ една от двадесетте аминокиселини. Транспортните РНК молекули имат способността да се свързват с конкретна аминокиселина и притежават участък от веригата си съставен също от три нуклеотида, който се означава като антикодон. Взаимодействието между иРНК и тРНК се осъществява по принципът на комплементарността между кодона и антикодона, като при съответствие между тях се изграждат водородни връзки. Тази особеност на транслацията прави възможно подреждането на всяка аминокиселина в определен ред от полипептидната верига, от което пък зависи първичната структура на синтезираната белтъчина. В същото време водородните връзки са сравнително лабилни, което дава възможност за освобождаване на тРНК след отдаването на носената аминокиселина. Така тРНК могат да се използват многократно в процеса на транслацията. Както вече описахме при раздела генетичен код някои аминокиселини се кодират от един кодон, но други се кодират от два или повече кодона. Структурата на тРНК бе подробно разгледана в предходните радели.

 

Аминоацил-тРНК синтетази

Това са високоспецифични ензими, които могат да разпознават съответната аминокиселина и тРНК носеща съответният антикодон за тази аминокиселина. Тези ензими осъществяват свързването на тРНК със специфичната за тях аминокиселина. За всяка аминокиселина е установена отделна аминоацил тРНК синтетаза, т.е. в клетката се откриват 20 аминоацил-тРНК синтетази. От съществено значение за транслацията е връзката между антикодона и кодона, поради което бихме могли да предположим, че разпознаването между тези ензими и тРНК молекулите също се базира на антикодона. В разделът генетичен код посочихме, че едни аминокиселини се кодират от един кодон, докато някои аминокиселини се кодират от 5 и повече кодона, поради което не можем да твърдим, че разпознаването между тРНК и аминокиселините се базира на антикодона. Основна роля в този процес има акцепторното стъбло на тРНК. Там е открит участък (дискриминатор) от една база, чиято замяна с друга е достатъчна за да пренасочи тРНК към друга синтетеаза. Предполага се, че тези участъци са няколко, като заедно формират вторичен генетичен код (разпръснат по молекулата на тРНК), който е много по-сложен.

 

Как аминоацил-тРНК-синтетазите разпознават своите аминокиселини?

Тъй като броят на аминоацил-тРНК синтетазите е 20 и отговарят на броят на аминокиселините, то бихме могли да си зададем въпроса – как тези ензими разпознават и аденилират само една от всички аминокиселини. Процесът на разпознаването допълнително се усложнява от почти еднаквата химична структура на някои аминокиселини (фенилаланин – тирозин; валин - изолевцин). Разликата между аминокиселините фенилаланин и тирозин е наличието на една хидроксилна група в тирозина. Именно тази хидроксилна група позволява на ензима да изгради водородна връзка с аминокиселината, което му позволява да разпознае молекулата с която се свързва. Ензимите отговарящи за всяка аминокиселина могат да се свържат точно с тази за която имат специфична химична връзка в своя т. нар. каталитичен джоб. По този начин броят на сгрешените аминокиселини е под 1%. Аминоацил тРНК синтетазите притежават възможността да коригират допуснатите грешки. Малко след каталитичният джоб те притежават втори джоб (коректорски) джоб. В него може да се помести единствено специфичната за ензима аминокиселина. При попадането на друга тя се хидролизира и се освобождава от ензима. Чрез този механизъм на корекция погрешно свързаните аминокиселини спадат до 0,01%. Както виждаме тези ензими извършват невероятен контрол върху свързването на аминокиселините със съответните тРНК. Благодарение на тяхната точност рибозомите следят единствено за правилното изграждане на водородните връзки между кодон и антикодон.

 

Рибозоми и състав на рибозомите

По същество рибозомите са клетъчните органели, в които се срещат кодоните на иРНК и антикодоните на тРНК, носещи съответните аминокиселини. В тези органели се изграждат специфичните полипептидни вериги кодирани от даден ген и пренесени от иРНК. Рибозомите са жизненоважни органели, поради което при по-бързо растящите клетки тяхната маса е около 25% от общото тегло на клетката. Характерно за рибозомите при прокариотите е тяхната възможност да се свързват с иРНК още в процеса на транскрипция, докато при еукариотите това ставя едва след процесинга и експортирането на иРНК в цитоплазмата. Изграждането на полипептидните вериги при бактериите е доста по-бързо (до 20 АК/sec) в сравнение с еукариотите (до 4 АК/sec). Във всеки момент от синтезата на белтък една рибозома може да бъде ангажирана само с една иРНК и може да синтезира само една полипептидна верига. След синтезирането на съответната белтъчина и отделянето на иРНК от рибозомата, както рибозомата така и иРНК молекулата могат да бъдат ангажирани в нов процес на синтез.

Рибозомите са изградени от две субединици – малка и голяма, като основните им градивни единици са рРНК и белтъчини. Малката субединица е изградена от 21 белтъка означавани като S белтъци (S – small). Голямата субединица съдържа 34 белтъка – L – белтъци (L-large). Според константата си на седиментация двете частици при бактериите се означават като 30S и 50 S. Всяка бактериална рибозома съдържа три инкорпорирани в нея рРНК молекули. Малката субединица съдържа една рРНК (16S рРНК), а голямата две рРНК молекули (23S и 5S). Характерно за рибозомните РНК молекули е, че също както и тРНК, те имат много сложна вторична и третична структура, което води до няколко двойноверижни участъка. Пространствената структура на рРНКите се дължи на взаимодействията им с рибозомните белтъчини, както и на взаимодействията между самите рРНКи.

 

Функционални участъци в рибозомите

Активният център (пептидил трансферазен) на рибозомите е ситуиран в голямата субединица и е изграден от рРНК. Декодиращият център е разположен в малката субединица и отговаря за превеждането на последователността от кодони в последователност от аминокиселини в полипептидна верига. За да протече пептидил трансферазната реакция е необходимо рибозомата да свърже поне две тРНК, което означава че рибозомата притежава три места за свързването на тРНК:

• А- място – тук се свързва аминоацилираната тРНК, която предстои да бъде използвана в синтезата на белтък.
• Р – място – тук синтезиращата се полипептидна верига се прехвърля върху аминоацилираната тРНК на А място.
• Е - място – тук тРНК от Р мястото се хидролизира от връзката си с белтъка и се отделя от рибозомата.

И трите описани места за свързване се формират от двете единици на рибозомата. Информационната РНК навлиза в и излиза от рибозомата посредством два канала. Входният е много тесен, което предотвратява навлизането на иРНК образувала вторични структури (двойноверижни участъци). Между двата канала е разположен декодиращият център на рибозомата. Тук се разполагат двата кодона на иРНК, с които контактуват двете тРНК (в Р мястото и в А мястото). За да се избегне преповтаряне на отделни нуклеотиди (тъй като във всеки момент в декодиращият център има общо 6 нуклеотида) иРНК прави леко пречупване между двата центъра (Р и А).

Синтезираният полипептид напуска рибозомата през сравнително тесен канал разположен в голямата субединица на рибозомата. През този канал може да минат полипептидни вериги, които не са нагънати в пространството, поради което пространствената конформация на белтъчините се извършва едва след тоталното им отделяне от рибозомата.

 

ИНИЦИАЦИЯ на транслацията при прокариоти

Преди започване синтезата на белтъчините малката и голямата субединица са разделени една от друга. При прокариотите транслацията започва с оформянето на комплекс между иРНК, рибозомата и тРНК, носеща аминокиселината формилметионин. Поради факта, че при всички прокариоти процеса се инициира от включването именно на тази амининокиселина, тРНК молекулата носител е наречена инициаторна тРНК. Формилирането на аминогрупата на метионина позволява следващата аминокиселина да бъде свързана единствено към карбоксилната група. Тази малка особеност всъщност задава и посоката на синтезираните полипептидни вериги – от N-края към СООН – края. След края на транслацията формилметионина се отстранява от веригата посредством ензима метиониндеформилаза. Така, въпреки че това е първата аминокиселина в процеса на транслацията тя не се съдържа в началото на ППВ.

Информационната РНК молекула се свързва с малката субединица на рибозомата благодарение на комплементарните взаимодействия между нея и 16S рРНК. След присъединяването и на голямата субединица в процеса на елонгацията стартовият кодон се разполага в Р мястото. Независимо от стартовият кодон (УУГ, ГУГ,АУГ) на конкретният ген, към него винаги се съединява инициаторната тРНК, носеща аминокиселината формилметионин. На този етап инициаторният комплекс се допълва и от три иницииращи транслацията фактора - IF1, IF2 и IF3. Енергията за процеса се получава от хидролизата на ГТФ. Всеки от трите фактора на инициацията изпълнява конкретни функции:

• IF1 – свързва се към А мястото, като така провокира инициаторната тРНК да се свърже с Р – мястото.
• IF2 – представлява ензим, който предизвиква хидролиза на ГТФ. Спомага свързването на инициаторната тРНК с Р мястото.
• IF3 – за протичането на инициацията е необходимо двете субединици да са разделени по между си, затова този фактор се свързва с малката субединица и пречи на асоциацията и с голямата.

След свързването на иницииращите фактори към малката субединца към нея се присъединяват и тРНК и информационната РНК. Както вече описахме, независимо от първият кодон на иРНК, винаги към комплекса се присъединява инициаторната тРНК, т.е. на този етап все още не са започнали взаимоотношенията кодон – антикодон. След като постъпи съответната тРНК, отговаряща на първият кодон на иРНК, настъпват промени в IF3 и към комплекса се присъединява голямата субединица. Това присъединяване стимулира хидролизата на ГТФ до ГДФ. Описаните до тук моменти от инициацията достигат до образуването на интактна рибозома в началото на иРНК, с наличие на инициаторна тРНК в Р мястото и празен А център.

При еукариотните клетки, описаните механизми са почти идентични. При тях свързването на инициаторната тРНК предшества свързването на иРНК. Инициаторната тРНК носи метионин и се означава като Мет-тРНК. Инициращите вектори не са само три, а около 30 на брой и извършват подобни функции, както при прокариотите. Стартовият кодон при еукариотите обикновено е АУГ.

 

Елонгация на трнаслацията

В процеса на елонгацията на транслацията участие вземат три основни фактора – EF-Tu, EF-G и EF-Ts. Не са установени съществени разлики между про- и еукариотните клетки. Транслацията е сравнително точен процес, но въпреки това се случва погрешното включване на аминокиселина в полипептида (една на 10 000 аминокиселини).

Механизъм на процеса

При взаимодействието на карбоксилната (COOH) група на предшестващата и амино (NH) групата на аминокиселината в А центъра, между тях се изгражда пептидна връзка. Процеса се катализира от ензима пептидилтрансфераза. На следващият етап иницииращата тРНК се освобождава от дипептида и напуска Р центъра. Локализираната в А центъра тРНК се прехвърля върху Р центъра и така А центъра остава свободен. Този процес се означава като транслокация и се катализира от ензима транслоказа. Участие при прехвърлянето на тРНК взема и факторът на елонгацията EF-G. В същото време рибозомата се премества с един кодон напред по веригата на иРНК (посока 5‘>3‘). Тъй като А центъра е свободен в него навлиза трета аминоацил тРНК, носеща нова аминокиселина и се свързва комплементарно поредният кодон от иРНК. Отново настъпва образуване на пептидни връзки между предходната и следващата аминокиселина и т.н. Така в зависимост от кодоните в иРНК се синтезира съответната полипептидна верига, специфична за конкретният вид клетка.

През този етап от транслацията настъпват три основни събития:

1. В А центъра постъпва втората тРНК (поредната) носеща съответната активирана аминокиселина и се свързва с кодона на иРНК.
2. Изгражда се пептидна връзка между аминокиселините в А центъра и Р центъра. Участие в този процес взема ензима пептидилтрансфераза.
3. Транспортната РНК в Р мястото се освобождава от носената аминокиселина и напуска това място. Образуваната пептидил тРНК в А мястото и кореспондиращият и кодон на иРНК се преместват в Р мястото. Това преместване се означава като транслокация.

 

Терминация на транслацията

Транслацията се преустановява, когато в А центъра постъпи един от т.нар. стоп кодони – УАГ, УАА или УГА. Тези стоп кодони не се разпознават от нито една тРНК, поради което нито една тРНК не се свързва с тях. Стоп кодоните се разпознават от специфични белтъчини наречени отделящи фактори (releasing factors). Тези фактори спомагат отделянето на ППВ от Р центъра. Съществуват два класа отделящи фактори:

1. Клас – се делят на два вида:
   1. RF1 - разпoзнава кодона УАГ 
   2. RF2 – разпознава кодона УГА

Третият кодон (УАА) се разпознава и от двата вида отделящи фактори.

1. Клас – факторите от този клас спомагат отделянето на факторите от клас I и освобождаването на веригата. Прокариотите притежават само един фактор от II клас – RF3.  

Синхронизация на биосинтезата на белтъчините

Биосинтезата на белтъците е цикличен процес. Характерно за него е, че с една молекула иРНК може едновременно да се свържат няколко рибозоми, образуващи полизомен комплекс. Във всяка свързана рибозома се синтезира по една ППВ, което позволява на клетката да синтезира много бързо нужните и белтъчини, а и да използва максимално малкият брой иРНК молекули с кратка продължителност на съществуване (обикновено до около 10 min.).

Отстраняване на дефектни мРНКи и техни белтъчни продукти по време на

транслацията

Поради своята едноверижност иРНК е многократно по-уязвима в сравнение с двойноверижната ДНК молекула. Разкъсването на веригата на иРНК е често срещано явление, което от своя страна води до синтезата на по-къси белтъчини. Такива иРНК са в резултат на взнезапно прекъсната транскрипция, нуклеазно въздействие от ендонуклеазите в клетката или различни дефекти в ДНК матрицата, които променят рамката на четене. При тези повредени иРНК липсва стоп кодон, поради което краят на веригата не се разпознава от отделящите фактори, а от друга страна няма тРНК която да се присъедини поради изчерпването на иРНК. В такива случаи при бактериите се намесва една хибридна молекула съставена от информационна и транспортна РНК (tmRNA). Тя има свойството да открива и свързва заседнали рибозоми. След като се свърже, тя навлиза в канала отговорен за свързването на иРНК. Участъкът от tm РНК изграден от иРНК започва последователно да свързва съответните за него тРНК. Обикновено се касае за около 10 кодона последният от които е стоп кодон. По този механизъм рибозомата се освобождава от „клопката“ в която е попаднала, но към ППВ се присъединяват аминокиселини, които не са присъщи за нея.

При наличието на преждевременен стоп кодон в иРНК (възникнал при грешка в сплайсинга, мутации и др.) се задейства друг механизъм, който разгражда повредената РНК молекула. По този начин се извършва предварителен скрининг на всички иРНК преди започването на транслацията.

При еукариотите е възникнал специфичен механизъм, който едновременно унищожава иРНКите, при които липсват стоп кодони и дефектните ППВ. След като рибозомата синтезира всички налични кодони тя транслира полиадениловата (поли А) опашка в лизинови аминокиселини. Поради липсата на стоп кодон се достига до момент, в който тя засяда по описаният вече начин. На този етап се намесва специфичен белтък наречен Ski 7.  Този белтък дисоциира рибозомата и привлича 3‘>5‘ екзонуклеазата за да разгради дефектната иРНК. В същото време полилизиновата опашка на белтъка се напада от протеолитичните ензими в клетката и се разгражда.

 

БЕЛТЪЧЕН СПЛАЙСИНГ

Както вече споменахме теорията, че един ген отговаря за една полипептидна верига вече се смята за грешна поради откриването на механизмите на сплайсинга на пре иРНК и възможността от един ген да бъдат синтезирани дори хиляди различни ППВ. Установено е и посттранслационно зреене на белтъчините, което показва, че в структурните гени се съдържа много повече информация отколкото се е предполагало. Такова посттранслационно зреене на белтъчините е открито при мезофилни бактерии, дрожди и др. Процесът се изразява в изрязването на белтък-предшествениците на вътрешните белтъчни сегменти (интеини) и свързването на флакиращите тези сегменти NH и COOH крайща (екстеини). Процесът се извършва много бързо без участието на допълнителни белтъчини.

 

Регулация на генната експресия

Известно е, че всяка клетка в многоклетъчният организъм е тотипотентна, т.е. тя съдържа цялата генетична информация на организма. Въпреки, че съдържат цялата генетична програма клетките в различните тъкани се отличават със специфичен строеж и функция. Диференциацията на клетките се осъществява благодарение на избирателната транскрипция на гените, при която едни гени се експресират в клетките на едни тъкани, а други гени в други тъкани. Установено е, че дори специфичните за даден клетъчен клон гени не се експресират постоянно, а само тогава когато продуктите им са необхдими на клетката. Въз основа на задълбочени проучвания е доказано, че в клетката никога не функционират повече от 10-15% от гените. Останалата част от генома на клетката е функционално неактивен, т.е. гените не са експресирани. Генната експресия при еукариотите и прокариотите се регулира посредством различни клетъчни механизми.

 

Регулация при прокариоти

Регулацията на гената експресия при прокариотите е далеч по-опростена в сравнение с еукариотните клетки. Едни от първите автори описали тези механизми при бактерията E. coli са Жакоб и Моно. Авторите създават така нареченият модел на оперона, според който всеки оперон в кръговата ДНК молекула съдържа следните категории участъци:

• Промоторен участък – разполага се преди структорните гени и притежава способността да се свързва със специфични белтъчини.
• Ген оператор – разполага се между структорните гени и промоторният участък.
• Структурни гени – кодиращи специфични за клетката полипептиди, рРНК и тРНК.
• Терминаторен участък – разполага се след структорните гени.

Горепосочените автори разработват модел за генетичната регулация на лактозният оперон при E. coli, който се състои в следното: При добавяне на лактоза в хранителната среда в която се развиват бактериите в техните клетки почти веднага се синтезират ензимите b-галактозидаза, галактопермеаза и трансацетилаза. Тези ензими катализират разграждането на лактозата в следствие на което клетката я включва в енергийните си механизми. След разграждането на цялото количесто от субстрата (лактозата), синтезата на ензимите се преустановява. Лактозният оперон е съставен от последователно подредени – промотор, ген оператор, трите структорни гена (отговорни за синтезата на ензимите) и терминатор. Процесът започва, когато към промотора се присъедини специфичен белтък, наречен активатор. Този ензим активира свързването на ензима ДНК зависима РНК полимераза с оперона и поставя началото на транскрипцията. Ген оператора е изграден от 21 нуклеотидни двойки и участва в регулацията на функционирането на оперона. Той кодира специфична белтъчина наречена репресор. При пълното разграждане на лактозата в хранителната среда тя се прикрепя към ген оператора и блокира по-нататъчното придвижване на РНК полимеразата. Съществува специфичен афенитет на тази белтъчина (репресор) към лактозата като дори при най-малки количества тя се свързва със сложната захар и ген операторът се отключва. След пълното изчерпване на лактозата репресора отново се свързва с ген регулатора и транскрипцията се преустановява. Трите структорни гена са подредени един след друг без прекъсване и са съставени от около 6000 нуклеотидни двойки. Терминаторът служи като сигнал за прекратяване на транскрипцията на структорните гени. По този начин гените разположени в лактозният оперон се експресират само когато са необходими на клетката – когато в средата има наличие на лактоза.

Описан е и друг механизъм за контрол на ензимната синтеза, при който ензимите се синтезират постоянно в клетката. При натрупване на излишни количества от продуцираното вещество синтезата на ензимите се преустановява. Пример за такъв тип регулация може да бъде даден с анаболитният триптофан оперон. Този оперон се състои от промотор, ген опреатор, 5 структорни гена с обща дължина около 7000 нуклеотида и терминатор. Тъй като триптофана е от постоянна необходимост в клетката, репресорът не оказва влияние върху ген оператора. При получаване на излишни количества от тази незаменима аминокиселина репресора се свързва с оператора и го активира. В резултат на това взаимодействие транскрипцията на оперона се блокира, т.е. експресията на структурните гени се преустановява. При изчерпването на триптофана в клетката, репресора се освобождава и освобождава ген оператора. По този фин механизъм клетката управлява синтезата на триптофан в зависимост от нуждите си.

Описаните два механизма обхващат само два оперона при един бактериен вид, но функционалните особености са идентични при почти всички прокариоти. Обикновено структорните гени са от 1 до 15, като всеки от тях е отговорен за синтезата на белтък участващ на определен етап от дадена метаболитна верига. Това означава, че гените разположени във всеки оперон са функционално свързани и се транскрибират в пакет. При повечето оперони има само един промоторен участък, но са описани и специфични оперони с два промотора, което позволява по-прецизната регулация на оперона.

 

Регулация при еукариоти

Регулацията на генната експресия при еукариотите е един от най-изучаваните процеси на нашият век. Макар да съществуват известни прилики с контрола на експресията при прокариотите, еукариотите имат далеч по-сложни регулаторни механизми. Тук също се наблюдават структурни и регулаторни участъци, но те не са подредени един след друг в оперони, а са разположени на различни разстояния един от друг. Съгласуваното експресиране на гени разположени в различни локуси на хромозомата или дори в различни хромозоми е един от най-интимните механизми в еукариотната клетка. При някои еукариотни клетки е наблюдавана и групова регулация, споделяща сходни правила с описаните при модела на оперона. За сега е известно, че генната експресия при еукариотите може да бъде регулирана на следните нива:

• Регулация на транскрипционно ниво – Характерно за транскрипцията е, че свързването на трите типа РНК полимерази с промоторите (регулаторни участъци в ДНК) се осъществява посредством белтъчини, означавани като транскрипционни фактори. Съществуват и друга група белтъчини отговарящи за терминацията на транскрипцията – фактори на терминацията. Важно е да отбележим, че всяка от трите РНК полимерази разпознава различна нуклеотидна последователност, която взаимодейства със специфичен терминационен фактор.
• Регулация на посттранскрипционно ниво – Осъществява се при сплайсинга на хетероядрената РНК. Процесът се извършва в ядрото и по същество представлява изрязване на интроните и снаждане на екзоните на пре- информационната РНК молекула. При повечето еукариотни гени участъците междо екзон и интрон са изпълнени с къси нуклеотидни последователности. Сплайсингът се извършва благодарение на разпознаването на тези участъци от малките ядрени РНК молекули. Те се свързват с определен участък от първичната РНК и образуват комплекс означаван като сплайсозома. В тази структура интроните се изрязват, а екзоните се съединяват в една обща молекула означавана като зряла РНК. Доказано е, че в повечето случаи зрялата иРНК от един и същ ген не е еднаква. Явлението се нарича алтернативен сплайсинг и се дължи на различният брой и начина на подреждане на отделните екзони в молекулата иРНК. Понякога от първичната иРНК се изрязват едни екзони, а при други клетки се същите екзони се оставят в зрялата иРНК. Така в клетката се синтезират полипептидни вериги с различна дължина и различен аминокиселинен състав. За повечето от гените при бозайниците са установени по няколко иРНК молекули, което противоречи на вече остарялата максима „Един ген – една полипептидна верига“.
• Регулация на транслационно ниво – Установена е връзка между количеството и вида на тРНК в клетката и аминокиселинният състав в клетката. Така в клетките на определени тъкани по-голямата част от тРНК молекулите са отговорни за преноса само на една аминокиселина, докато при други клетки се срещат няколко вида тРНК. По този начин високоспециализираните клетки имат възможността да синтезират големи количества от специфичният за тях белтък. Бихме могли да предположим, че диференцираните клетки могат да контролират експресията на гените кодиращи различните тРНК, при което в различните етапи на клетчният цикал някои от тях са суперекспресирани, докато други се транскрибират в много ниски количества. Пример за такъв тип регулация можем да дадем с белтъкът фибрин при копринената пеперуда. Този белтък е изграден от аминокиселините аланин, глицин, серин и тирозин. В момента на синтезата на белтъка в клетката се откриват единствено четирите тРНК отговорни за преноса на тези аминокиселини до рибозомите.
• Други – към тази категория можем да отбележим прибавянето на метилна група към цитозиновите нуклеотиди в молекулата на ДНК. При застигане на такъв участък транскрипцията на гена се преустановява. Този механизъм се използва от клетката за регулация на някои от гените.

 

Въпроси за самоподготовка!

Процесът транскрипция протича в следната посока:

1. 5’>3’
2. 3’>5’
3. И в двете посоки
4. Друго (моля посочете)

Синтезата на иРНК се извършва от ензимът:

1. РНК полимераза
2. РНК зависима ДНК полимераза
3. Хеликаза
4. Метилаза

Какво означава абревиетурата ПИК:

1. Повърхностно информационен комплекс
2. Пре-инициационен комплекс
3. Първично – имитиращ комплекс
4. Първично изискуем комплекс

Сплайсозомите са изградени от:

1. Белтъци и РНК
2. Белтъци и ДНК
3. Белтъци, Въглехидрати и ДНК
4. Ензими и ДНК

Аминоацил-тРНК синтетазите са високоспецифични ензими, притежаващи свойството да разпознават:

1. Дадена аминокиселина и съответният за нея антикодон разположен в тРНК
2. Зрели вирусни частици, като така предотвратяват инфекциозният процес
3. Различни соли и витамини
4. Чужди ДНК молекули

Рибозомата притежава три места за свързването на тРНК. Те се означават като:

1. А място, Р място и Е място
2. Място Уотсън, Място на Крик и място на Льовенхук
3. Място на привличане, място на улавяне и място на синтез на ППВ
4. Нито един от посочените отговори

В процеса на елонгацията на транслацията участие вземат следните фактори:

1. EF-Tu
2. EF-G
3. EF-Ts
4. Нито един от посочените
5. Всички посочени

Транслацията се преустановява, когато в А центъра постъпи един от т.нар. стоп кодони. Кой от посочените кодони е стоп кодон:

1. УАУ
2. УГГ
3. УУГ
4. Нито един от посочените
5. Всички посочени